24. 유전자 운반체 -2

지난 포스팅에서는 유전자 운반체로 흔히 사용되는 plasmid에 대해 알아봤습니다. DNA의 모양, 크기, 사용 목적에 따라 다양한 운반체를 사용해야 하는데, 큰 DNA를 운반하는 데 자주 사용되는 phage와 cosmid에 대해 살펴보겠습니다.

 

A. Phage

Phage(파지)는 박테리아를 숙주로 삼아 살아가는 일종의 바이러스로, 박테리오파지라고도 합니다. 형태는 다양하지만 기본적으로 유전자 핵산을 내부에 넣고 단백질이 둘러싸고 있는 모습을 보여줍니다.
다양한 유형의 파지 중 E. coli 바이러스인 bacteriophage lambda(λ)는 plasmid에 비해 상대적으로 큰 외래 유전자를 복제하는 데 적합합니다. λ Phage는 유전자로서 약 50kb에 해당하는 이중 가닥 DNA와 DNA 분자의 양쪽 끝에 단일 가닥 형태로 12개의 뉴클레오타이드에 해당하는 cohesive end(cos site)을 가지고 있습니다. 이 파지가 숙주 대장균 세포를 감염시키면 파지 DNA가 세포로 들어가 cos site 간의 수소 결합에 의해 원형화되고, 감염 초기에는 파지 유전자가 이 상태로 전사됩니다. 그 후 파지의 운명은 파지 DNA의 복제 방식에 따라 용균 경로(lytic pathway)와 용원 경로(lysogenic pathway)라는 두 가지 경로 중 하나를 선택하는 것입니다.
λ 파지의 생애사에서 용균 경로를 선택하면 원형 파지 DNA가 독립적으로 복제되어 수많은 파지 입자가 생성되어 숙주 세포가 파괴됩니다. 이에 비해 용원성 경로를 선택하면 원형 파지 DNA가 숙주의 염색체 DNA와 함께 복제되어 유전됩니다.
파지가 파지 유전자의 복제와 함께 증식하면 복제된 유전자는 파지 껍질에 해당하는 머리와 꼬리로 둘러싸이게 됩니다. 이때 약 50kb에 해당하는 유전자가 파지 머리 부분에 들어가 꼬리 부분이 연결되고 파지가 완성됩니다. 이를 headful packaging이라고 합니다.
이러한 λ 파지 특성을 벡터로 사용할 수 있는 방법을 찾았습니다. 완전한 야생형 파지 DNA를 벡터로 사용하는 대신 용균 성장에 필요하지 않은 DNA와 같은 불필요한 부분을 잘라 변형하여 벡터로 유용한 유도체를 생산합니다.
λ 벡터를 제한 효소로 완전히 자르고 진핵생물 DNA를 부분적으로 절단하여 연결하면 큰 재조합 DNA가 생성됩니다.
이러한 거대한 DNA 분자가 파지 입자 형성에 필요한 다양한 단백질과 혼합되면 DNA 분자는 파지 껍질로 둘러싸여 활성 박테리오파지를 생성합니다. genomic library는 일반적으로 대장균을 숙주로 하여 박테리오파지를 감염시키고 증폭하여 만들어집니다.
λ 파지 유전자의 왼쪽 부분(left arm)에는 주로 머리와 꼬리를 만드는 데 필요한 유전 정보가 포함되어 있으며, 오른쪽 부분(right arm)에는 각각 DNA 복제와 용균(cell lysis)에 필요한 유전 정보가 포함되어 있습니다. 중간 영역(middle region)에는 파지 유전자가 숙주 세포의 염색체 DNA와 결합하거나 분리하는 데 필요한 유전 정보가 포함되어 있습니다.
중간 부위에 해당하는 유전자의 길이는 약 20kb에 해당합니다. 이 20kb의 중간 부분에 있는 유전자는 불필요하게 벡터 역할을 하기 때문에 잘라내는 것이 무방하고, 대신 외래 유전자를 삽입해도 파지로 생활하는 데 불편함이 없습니다. 즉, 원래 유전자의 약 60%(약 50kb)만 유지하면 파지를 벡터로 사용할 수 있습니다.
일반적으로 야생형 유전자의 78~100%(38.5~52.0kb)의 DNA를 파지 유전자로 헤드풀 패키징하는 데 사용할 수 있어 약 9~23kb에 해당하는 외래 DNA를 λ 벡터에 복제할 수 있습니다. 따라서 λ 파지 벡터는 플라스미드 벡터에 비해 분자량이 상대적으로 큰 외래 DNA를 cloning하는 데 사용할 수 있다는 장점이 있지만, 파지 벡터는 플라스미드 벡터에 비해 취급, 보관, 관리에 어려움이 있습니다. 이러한 문제에 대한 개선된 해결책은 아래에 설명된 cosmid 벡터입니다.

B. Cosmid

Cosmid(코스미드)는 플라스미드 역할을 하고 파지 역할을 하는 거대 DNA 분자 cloning용 벡터로, 플라스미드 벡터와 같이 코스미드 자체의 크기가 5kb 내외로 매우 작아 약 40~45kb에 해당하는 DNA 분자를 cloning하는 데 사용됩니다. 코스미드는 플라스미드와 같이 자가 복제에 필요한 유전자를 가지고 있어 파지보다 취급 및 보관이 용이하기 때문에 박테리아 세포에서 독립적으로 존재할 수 있습니다. 또한 항생제 내성 유전자 마커가 있어 선택과 추적이 용이합니다. 그리고 λ 파지 유래의 cos 유전자(site)를 가지고 있어 생체 외 시험관에서 재조합 유전자를 사용하여 헤드풀 패키징으로 파지 입자를 만들 수 있습니다. Transduction은 거대 분자를 숙주 세포에 도입하는 방법으로 transformation보다 더 효과적입니다. 시험관에서 숙주 세포에 헤드풀 패키징으로 파지 입자를 대장균에 감염시키면 파지에 포함된 재조합 DNA가 숙주 세포로 들어갑니다. 코스미드는 분자량이 큰 외래 DNA를 cloning하는 데 적합하며 λ 파지와 같은 genomic library를 만드는 데 유용합니다.

 

Plasmid, phage, Cosmid 외에도 다양한 종류의 유전자 운반체가 있으므로 숙주세포의 종류, 외래유전자의 특성 및 종류, cloning 목적에 따라 사용해야 합니다. 다음 포스팅에서는 숙주세포와 재조합체 DNA 구성법에 대하여 간단히 살펴보도록 하겠습니다.