23. 제한 효소와 유전자 운반체 -1

이번 포스팅에서는 유전자 재조합에 사용되는 제한 효소와 유전자 운반체 중 Plasmid에 대하여 알아보도록 하겠습니다.

A. 제한 효소

Restriction endonuclease라고도 합니다. 일반적으로 제한 효소는 DNA 분자를 구성하는 뉴클레오타이드의 특정 염기 서열을 인식하고 DNA 분자를 절단하는 효소로 사용됩니다. 이러한 효소는 뉴클레오타이드 사이의 이인산에스테르(phosphodiester) 결합을 가수분해합니다.
각 효소의 특성에 따라 세 가지 유형으로 분류할 수 있습니다.

 

① Type I 제한 효소
DNA의 특정 염기 서열을 인식하고 인식 부위의 염기 서열에서 500~2500bp 떨어진 뉴클레오타이드 사이의 이인산 결합을 가수분해하는 효소입니다. 5~6개의 소단위체(subunit)로 구성되며, 효소 활성을 위해서는 Mg2+, ATP, S-adenosylmethionine이 필요합니다.

 

② Type II 제한 효소
DNA의 특정 염기 서열을 인식하고 인식 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 사이의 이인산에스테르 결합을 가수분해하는 효소로, Mg2+의 존재 하에 활성이 나타납니다. 이 효소는 산업적으로 대량 생산되며 유전자 변형의 일반적인 필요성입니다. 500가지 이상의 다양한 효소가 알려져 있습니다.
이러한 유형의 효소 중 DNA를 가수분해하여 접착 말단을 만드는 효소(cohesive/sticky end)와 평활성 말단을 만드는 효소(blunt/flush end)의 두 가지 범주가 있습니다. 전자의 예로는 EcoRI, BamHI, Hind III가 있으며 후자의 예로는 Sma I가 있습니다. DNA 분자의 이중 나선 구조를 형성하는 두 가닥의 길이는 같고 접착 말단의 반대쪽에서는 가수분해 후 생성되는 사슬 끝의 모양이 쉽게 겹칩니다. 이는 DNA 분자를 구성하는 두 가닥 중 하나가 다른 가닥보다 길거나 짧을 때입니다.

 

③ Type III 제한 효소
특정 염기 서열을 인식하고 인식 부위에서 24~27bp 떨어진 뉴클레오타이드 사이의 이인산에스테르 결합을 가수분해하는 효소입니다. 이 활성을 위해서는 Mg2+, ATP, S-adeno- sylmethionine이 필요합니다.

 

B. 유전자 운반체

유전자 운반체는 종종 vector라고 불리며, 특정 유전자 DNA를 원하는 숙주 세포로 가져와 증폭하는 기능을 하는 DNA 분자입니다. 특정 유전자 DNA는 vector와 공유 결합을 형성하여 vector처럼 작용합니다. vector로 사용하려면 다음과 같은 조건의 DNA가 바람직합니다.
- 숙주 세포에서 안정적으로 존재하면서 스스로 복제하고 증식할 수 있어야 합니다.
- 분자가 작을수록 분해, 절단, 재결합과 같은 취급이 용이합니다.
- 다른 DNA 조각과 구별하기 위해 마커(marker)로 사용할 수 있는 유전자가 있어야 합니다.
- 제한 효소에 의해 절단되더라도 유전자 운반체로서의 필수 기능이 손실되지 않는 부위에 외래 유전자 DNA를 삽입해야 합니다.
숙주 세포를 박테리아로 제한함으로써 이러한 운반체의 특성을 가진 DNA는 그 형태에 따라 plasmid, 바이러스(bacteiophage), cosmid 등으로 나눌 수 있습니다. 이들은 고유한 생리적 특성, 강점과 약점을 가지고 있으므로 사용 목적에 따라 선택됩니다.

 

① Plasmid
Plasmid는 스스로 복제할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 염색체 DNA에서 분리되어 세포질(염색체 외 공유 폐쇄 원형 DNA)에 존재하는 두 개의 원형 DNA(extrachromosomal covalently closed circular DNA)입니다. 크기는 다양하지만, 실제로 유전자 변형에 사용되는 Plasmid는 대부분 10kb 미만의 작은 DNA입니다. 자연에는 다양한 종류의 Plasmid가 있으며, 이러한 Plasmid는 종류에 따라 다음과 같은 독특한 유전적 특성을 나타낼 수 있습니다.
a. 결합을 통해 유전 물질을 전달할 수 있는 fertility가 있습니다.
b. 항생제(내성, resistance)에 대한 내성을 나타내기 때문에 이러한 유형의 plasmid를 가진 박테리아는 항생제를 치료해도 죽지 않습니다.
c. bacteriocin, methylenemycin, chloramphenicol과 같은 항생제를 생산하여 다른 미생물의 성장을 억제합니다.
d. Pseudomonas의 경우와 마찬가지로 camphor, octane, octanol과 같은 난분해성 유기 화합물을 분해하고 활용할 수 있는 특성이 있습니다.
e. Enterotoxin과 hemolysin과 같은 독소와 항원을 형성합니다.
f.  Agrobacterium 속 박테리아가 소유한 Ti plasmid는 종양을 생성하는 능력이 있습니다.
g. Plasmid는 또한 근류균인 rhizobia와 같은 식물체에서 뿌리 돌기의 형성을 유도할 수 있습니다.
h. Streptomyces에서는 포자 형성 능력이 향상됩니다.
자연 생태계에는 다양한 종류의 plasmid가 있습니다. 그러나 유전자 재조합에 사용되는 plasmid는 자연 상태가 아닙니다. 자연 상태에서 plasmid를 인위적으로 변형시킨 후 불필요한 부분을 vector로 제거하고 누락된 부분을 보충하여 vector로 기본 조건을 갖게 한 후 사용합니다.
유전자 복제 초기에 많이 사용된 plasmid의 한 예는 자가 복제에 필요한 부위 ori(origin of replication), 항생제 암피실린에 내성이 있는 유전자, 항생제 테트라사이클린에 내성이 있는 유전자, 다양한 제한 효소에 의해 가수분해되는 부위가 있는 pBR322입니다. 크기는 약 4.3kb이며 작습니다.
plasmid를 vector로 사용할 경우 plasmid에 결합하여 운반할 수 있는 외래 유전자(foreign DNA 또는 target DNA)의 크기는 약 10kb로 제한됩니다. 외래 유전자나 전체 유전자의 크기가 너무 크면 재조합 반응을 처리하기 어렵기 때문입니다. plasmid vector의 단점은 복제할 수 있는 DNA의 크기가 작고 제한적이라는 점이지만 취급과 보관이 용이하다는 장점도 있습니다.

생물공학의 기본이 되는 유전자 재조합에서 사용되는 제한 효소와 유전자 운반체 중 하나인 Plasmid에 대하여 알아보았습니다. 다음 포스팅에서는 유전자 운반체 phage에 대하여 살펴보도록 하겠습니다.