19. 돌연변이주의 선발방법 및 균주의 보존

지난 포스팅에 이어 돌연변이 법에 의한 미생물 육종 중 '돌연변이 주의 선별 방법'과 선별 후 '균주 보존' 방법에 대하여 살펴보도록 하겠습니다.

 

A. 돌연변이를 선택하는 방법

대사 산물 생산성을 높이기 위해 사용되는 돌연변이주 중 영양요구성 변이주(auxotroph)는 대표적인 영양소가 필요한 변이주입니다. 미생물 대사 경로 중 산물 C를 대량 생산하기 위해 C 이후 대사 경로의 한 단계가 결핍된 돌연변이 균주를 얻습니다. 대사 경로의 최종 산물 E를 생산할 수 없는 이러한 돌연변이체는 배양 과정에서 배양 배지에 최종 산물 E를 첨가하지 않으면 성장할 수 없습니다. 따라서 피드백을 조절할 수 없는 수준에서 소량의 E를 첨가하면서 다량의 C를 축적할 수 있습니다. 이 방법으로 개발된 영양 돌연변이주는 Glutamate, lysine, threonine 등 발효 생산에 활용됩니다.
효과적인 돌연변이 균주가 만들어지더라도 다양한 유형의 돌연변이 균주와 야생 균주의 혼합물에서 원하는 균주만 분리해야 합니다. 그러나 각 세포를 차례로 테스트하는 것은 매우 비효율적입니다. 따라서 원하는 돌연변이를 효과적으로 분리하는 방법으로 penicillin 농축법과 replica plating 법이 사용됩니다.

 

① penicillin 농축법
페니실린 농축법은 증식하는 세포에만 작용하는 세포의 세포벽 합성을 억제하는 방법입니다. 특정 대사 과정의 결핍으로 인해 특정 영양소와 증식하지 않는 영양 돌연변이 또는 돌연변이 균주는 성장이 멈춘 상태를 유지하며, 야생 균주는 성장 조건을 유도하여 야생 균주만 선택적으로 죽일 수 있습니다. 궁극적으로 돌연변이의 상대 농도를 높이는 방법입니다.
돌연변이 배양 용액을 먼저 완전한 배양 배지에서 증식시킵니다. 이 단계에서 사멸되지 않은 박테리아는 영양요구성을 갖는 돌연변이체와 야생형 균주 사이에서 충분히 증식합니다. 배양된 세포를 세척한 후 최소 배지에서 현탁 배양 중에 페니실린을 첨가하면 성장이 멈춘 상태에서 영양요구성 변이주는 페니실린에 의해 죽지 않고 영양요구성을 갖지 않는 균주는 페니실린에 의해 죽습니다. 이러한 방식으로 영양요구성 변이주는 상대적으로 증가합니다. 돌연변이 균주가 농축된 배양액을 다시 완전 배지로 옮기고 이 과정을 첫 번째 공정부터 2~3회 반복하면 산업적으로 원하는 영양이 필요한 돌연변이 균주가 고농도로 농축됩니다.

 

② replica plating 법
이 방법은 영양요구성 변이주 중 원하는 특성을 가진 돌연변이 균주를 선택하는 데 자주 사용됩니다. 먼저 미생물 배양액을 희석한 다음 한천 배지가 있는 페트리디쉬(petridish)에 도말합니다. 충분한 성장 후 한천 배지 표면에 눈에 보이는 박테리아 군집이 형성되면 각 페트리디쉬를 거꾸로 뒤집고 원형 멸균 벨벳(velvet)으로 누릅니다. 각 박테리아 군집의 세포를 벨벳에 묻어 있을 것으로 완전 배지 플레이트와 최소 배지 플레이트에서 각각 도장을 찍듯이 누름으로써 두 개의 복제 플레이트(replica plate)를 만들 수 있습니다.
완전 배양 배지 평판에서는 군락을 형성하지만 영양요구성 변이주는 최소 배양 배지 평판에선 군락을 형성하지 않습니다. 경우에 따라 다른 항생제 또는 analogue가 포함된 평판에서 replica plate를 만들 수 있으며, 항생제 내성이나 analogue 내성의 차이를 이용해 원하는 돌연변이 균주를 선택할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 조작 후 원하는 recombinant를 선별하는 데에도 사용됩니다.

B. 균주 보존

앞서 설명했듯이 미생물은 자연적으로 돌연변이를 일으킬 수 있는 가변적인 생물입니다. 주변에 존재하는 다양한 미생물에 의해 오염되었을 뿐만 아니라 지속해서 성장하도록 방치하면 대사산물이 축적되어 사멸될 수 있습니다. 따라서 필요한 균주는 목적에 따라 일정 기간 동안 적절한 방식으로 안전하게 보관해야 합니다. 별도로 선별된 미생물은 활성을 유지하고 활용할 수 있도록 적절한 보존 방법을 선택합니다. 이를 위해 다음과 같은 방법이 사용됩니다.

 

① 동결 건조 보존 방법
동결 건조된 미생물 포자는 장기간 보관 후 바로 발아하지 않습니다. 균주의 형태학적, 생리학적 특성에 변화가 없고 세균의 오염이 없으며 보존이 용이하기 때문에 미생물의 장기 보존을 위해 가장 보편적이고 널리 사용되는 방법입니다.
동결건조 보존법(lyophilization preservation)은 액체 질소 등으로 감압하여 배양한 세균을 신속하게 동결건조한 후 장기간 밀봉하는 방법입니다. 반영구적으로 보관할 수 있기 때문에 대부분의 균주 보존 기관에서 이 방법을 사용합니다. 동결건조된 바이알 내 균주는 보관이나 판매는 용이하지만 제조 시 전처리 시간이 길고 성가신 단점이 있습니다.

 

② 냉동 보존 방법
일부 미생물은 건조한 조건에서 생존율이 현저히 낮아 냉동 보관 시 장기간 보관할 수 있습니다. 냉동 보관은  -20~-196°C(액체 질소)의 온도 범위에서 냉동 보관하는 방법으로, 동해(東害) 억제제로 10~20% glycerine 또는 dimethylsulfoxide(DMSO)를 사용합니다. 미생물의 대사 활동을 중단함으로써 미생물의 활동을 유지할 수 있습니다.

 

③ 저온 보존 방법
저온 보존 방법은 계승 보존 방법이라고도 합니다. 미생물 균주가 한천 배지에서 충분히 자랄 수 있도록 고체 배양하여 저온에서 2~4℃에서 보관하는 방법입니다. 
이 방법에 보관할 때 균주의 생리 활성을 유지하기 위해 효모는 3~6개월에 한 번, 곰팡이와 박테리아는 6개월마다 새로운 배지에서 배양해야 합니다. 지속적인 실험이나 생산을 할 때 사용하는 방법으로 단기 보관에 사용됩니다. 하지만 이 방법은 오염 위험이 높고, 계대배양에 많은 인력이 필요하다는 단점이 있습니다.

 

④ 유동중층 보존 방법
유동중층 보존 방법(paraffin sealing)은 저온보존법처럼 저온살균한 사면 배양(slant culture)으로 충분히 배양한 미생물에 멸균 파라핀 오일(paraffin oil)을 층층이 쌓아 냉장 보관한 후 장기간 보관하는 방식입니다. 배지보다 약 1cm 높게 덮고 산소 공급을 차단하여 보존된 균주의 대사 작용과 수분 증발을 억제하고 보존하는 방법입니다. 3~4년 동안 보관할 수 있으며, 보관 기간 동안 기름이 마르는지 확인이 필요합니다.

 

⑤ 토양 보존 방법
장기 보존 방법으로 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 보관하는 데 사용되며 실온에서 보관할 수 있습니다. 수분이 약 20% 함유된 바람에 말린 토양을 시험관에 넣고 120°C에서 3시간 동안 멸균한 다음 미생물 포자 또는 균사체 현탁액 1ml와 잘 혼합하여 보관합니다. 주로 곰팡이와 방선균 포자를 이용한 보존에 사용됩니다.
또한 박테리아와 곰팡이를 보존하는 데 사용되는 토양 보존 방법과 유사한 모래 배양 방법이 있습니다. 포자를 20% glycerin 용액에 현탁하여 -20~-70℃에서 보관하는 등 다양한 방법이 있습니다. 균주에 따라 적절한 보관 방법을 선택해야 합니다.

 

이번 포스팅을 통해 돌연변이 주를 선별하는 다양한 방법과 균주를 보존하는 방법들을 알아보았습니다. 다음 포스팅에서는 생물공학의 꽃인 '유전자 재조합'에 대하여 알아보도록 하겠습니다.