17. 미생물의 분리선발

생물공학에 필수적인 미생물 배양의 장단점을 살펴본 후, 어떤 균주를 사용하고 어떤 과정으로 선발해야 하는지 살펴보겠습니다.

 

A. 유용한 균주에 대한 조건

미생물의 산업적 사용 단계는 자연에서 미생물을 분리하는 것이며, 별도로 선택된 균주가 산업적으로 사용되기 위해서는 다음과 같은 가능한 요건을 충족해야 합니다.
① 미생물이 가지고 있는 영양 특성(nutritional characteristics)으로서, 저렴한 원료나 미리 조성할 수 있는 정의된 배지(defined medium)로 인해 성장이 좋아야 합니다.
② 고온 또는 내열성 미생물로서 성장 적합 온도가 40°C 이상인 미생물은 대규모 발효에서 발효 열을 쉽게 제거하고 냉각 비용이 적으며 다른 미생물로 인한 오염 위험이 적어야 합니다.
③ 분리할 균주는 현재 사용 중인 공정이나 장비에 적합한 미생물이어야 합니다.
④ 생리적 및 유전적으로 안정적이며, 장기간 배양하는 동안 돌연변이 균주가 발생하거나 활동이 감소해서는 안 됩니다.
⑤ 원자재를 사용하는 제품으로 전환율이 높아야 하며, 단위 시간당 수율인 생산성이 높아야 합니다.
⑥ 배양 후에는 배양 용액에서 생산물을 쉽게 회수할 수 있어야 합니다.
상기 목적에 적합하고 상업적으로 이용할 수 있는 미생물 균주는 외국 기업 등에서 판매하는 경우가 있습니다. 그러나 대부분 회사에서 필요로 하는 균주를 자연에서 분리하여 번식시킵니다. 일반적으로 연구에 사용되는 균주는 보존 기관에서 구입할 수 있지만 경제적, 산업적 미생물은 특허권을 인정하고 있습니다. 따라서 사용을 시도할 때 높은 기술료를 지불해야 하므로 유용한 균주를 자연에서 분리하고 분리 균주를 개선하기 위한 노력은 꾸준히 이어지고 있습니다. 이는 우수한 생산성을 가진 유전 자원을 확보하는 것이 생물 산업에서 기업의 경쟁력에 가장 큰 영향을 미치기 때문입니다.
미생물을 분리할 때 분리의 원인이 되는 시료, 분리 방법, 배양 조건은 대상 미생물의 종류와 특성에 따라 달라지며, 분리 선택의 성패는 미생물에 의해 결정되는 경우가 많습니다. 최근 극한 환경에서 살아가는 미생물(extremophiles)을 분리하기 위한 많은 연구가 진행되고 있습니다. 일반적으로 토양, 동식물, 바닷물, 온천수, 하수 등과 같은 천연 시료를 사용하여 선택배지(selective medium)에서

ⓐ 집적배양(enrichment culture) 및 건조와 같은 샘플의 전처리

ⓑ 온도, pH, 압력과 같은 물리적 조건 조정

ⓒ 배지에 항생제 또는 성장 억제제 등의 화학물질을 첨가하여 배양
과 유사한 방식으로 배양한 후 필요한 특정 미생물을 순수하게 분리합니다.
미생물 균체의 구성은 단순한 화합물에서부터 점진적으로 복잡한 거대 분자로 구성됩니다. 따라서 분리할 미생물의 생리적, 유전적 미생물 구조는 단순 화합물의 특성을 점진적으로 고려하여 분리 배지를 선택해야 합니다. 이러한 이유로 미생물의 생리적 현상을 이해하는 것이 필요합니다.

B. 분리배지의 선택

미생물을 분리하는 데 사용되는 배지의 선택은 매우 중요하며, 이에 대한 지침은 다음과 같이 요약됩니다.
① 배양 배지의 구성 성분 중 C, N, P와 같은 영양 공급원을 조사하여 분리하려는 균주 이외의 미생물을 대상으로 성장을 제한(growth-limiting)할 수 있는 영양 공급원을 포함하는 배양 배지가 준비됩니다.
② 각 형태의 영양소 결핍에 대해 분리하려는 미생물의 성장에 영향을 미치지 않도록 대체할 수 있는 다른 충분한 영양 공급원을 사용하세요.
③ 성장 제한 영양원으로는 가능한 한 쉽게 구할 수 없는 고분자 형태(complex 또는 polymeric form)를 사용하는 것이 좋습니다. 대부분의 미생물이 쉽게 구할 수 있는 포도당과 같은 탄소원과 암모늄(NH4)염과 같은 질소원은 가급적 사용하지 않는 것이 좋습니다.
④ 배지에 Mg2+, Mn2+, Fe2+와 같은 미생물 성장에 영향을 미치는 보조 인자가 있는지 확인합니다.
⑤ 배양 중 pH에 심각한 변화를 일으키지 않도록 완충 작용이 수행되는 배양 배지가 준비됩니다.
상기 배양액의 생성은 분리할 특정 미생물만 선택적으로 증식할 수 있는 화학적 환경을 조성하여 불필요한 미생물의 성장을 억제할 수 있습니다. 필요한 경우 이온 강도, pH, 온도, 삼투압 등 물리적 환경을 조절하거나 항생제 첨가를 통해 필요한 미생물의 분리를 용이하게 할 수 있습니다. 예를 들어 특정 미생물의 분리 및 선별(screening)에는 목적에 맞는 선별 방법을 사용합니다. 일반적으로 유용한 물질의 생산을 확인하기 위한 항생제 생산 균주는 시험 균주(test strain)에 대한 성장 억제 정도(bioassay)를 측정하여 결정하고, 효소 생산 균주를 선별하기 위해 배양 여과액(culture filtrate)을 사용하여 효소 활성을 결정합니다.
일반적으로 분리를 시도하는 대부분의 미생물은 유용한 물질로 2차 대사산물(secondary metabolites)을 생산하는 균주입니다. 배지 선택과 검증 방법 선택에 주의를 기울이는 것이 중요한데, 이는 다양한 영양 공급원의 조절(regulation)로 인해 생산량이 크게 달라질 수 있기 때문입니다.

 

C. 새로운 물질의 검정

미생물이 새로운 물질을 검정하는 과정에서 앞서 언급한 방법으로 분리된 균주를 적절한 배양 조건에서 배양한 후, 다양한 검정 방법을 통해 유용한 물질이 형성되는지 배양 여과액을 확인합니다.
필요한 대사산물이 생성되는 것이 확인되면 배양액에서 물질을 추출하여 정제합니다. 그런 다음 필요에 따라 물리적 및 화학적 특성을 분석하기 위하여 필요에 따라 결정화하여 샘플을 준비합니다. 검정 과정에서 정제 정도는 물질마다 다르지만 일반적으로 단일 물질임을 확인해야 합니다.
분리 및 정제된 물질에 대해 녹는점, 용해도 등 다양한 물성을 먼저 측정하고 원소 분석을 통해 성분과 분자식을 결정하며, UV, IR, NMR, 질량분석 등의 기기분석을 통해 물질 구조를 결정하고 기존 발표 물질과 비교합니다. 필요한 경우 생물학적 특성을 살펴봄으로써 개발 가능성도 검토할 예정입니다. 일반적으로 새로운 물질이라는 사실을 알아내는 것은 매우 드물며, 여러 번의 반복적인 과정을 통해 신물질의 생산을 확인할 필요가 있습니다. 새로 분리된 균주가 생물학적 활성을 가진 새로운 물질을 생산한다는 사실이 밝혀지면 기존 전구체로부터 직접 발효, 화학 합성 또는 변형(modification)을 통해 생산하기에 경제성이 있는지를 판단하게 됩니다. 그런 다음 산업화 가능성이 판단되면 필요한 물질을 부착한 특허를 출원하고 균주 및 산업 생산을 개선하기 위한 다양한 최적 조건을 설정합니다.
위 과정을 통해 얻은 유용한 균주의 유전자 자원은 보존되며, 상업적으로 가치 있는 균주뿐만 아니라 분리된 균주 중 생리적 및 유전적 특성에 대한 연구 결과를 바탕으로 유용하다고 여겨지는 미생물도 유전자 자원으로 축적되어 필요한 연구자에게 제공됩니다.

 

산업적 이용을 위한 미생물 분리 선발에서 유용 미생물의 조건과 분리하는 방법 및 생산물에 대한 분석 방법에 대하여 알아보았습니다. 다음 포스팅에서는 미생물 배양의 산업화를 위한 돌연변이 법에 의한 미생물 육종에 대하여 알아보도록 하겠습니다.