27. 재조합 DNA 포함 clone 선별 분리법

재조합 DNA를 포함하는 수용체 세포(clone)는 전체 수용체 세포의 극히 일부에 불과하여 대부분의 세포가 재조합 DNA를 받아들일 수 없게 됩니다. 따라서 재조합 DNA를 포함하는 수용체 세포와 그렇지 않은 다른 일반 세포와 분리 및 선별할 필요가 있습니다.

 

A. Plasmid vector의 marker를 이용하여 선별하는 방법

플라스미드에 항생제 카나마이신과 테트라사이클린에 내성을 보이는 유전자가 있는 경우, 마커 유전자를 추적하여 재조합 플라스미드 DNA를 포함하는 클론을 분리할 수 있습니다.
숙주 세포와 재조합 플라스미드 DNA의 혼합물을 카나마이신이 포함된 배지에 퍼뜨리고 배양(확산)하면 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 숙주 세포만 성장합니다. 즉, 원래 플라스미드 벡터 또는 재조합 플라스미드 DNA를 포함하는 세포만 성장합니다. 이러한 카나마이신을 포함하는 배지에서 성장하는 군락(colony)을 카나마이신과 테트라사이클린을 모두 포함하는 배지로 옮기면 성장하지 않는 군락(colony)은 재조합 플라스미드 DNA를 포함하는 클론에 해당합니다.
이는 재조합 플라스미드 DNA에 테트라사이클린 내성 유전자 내부에 외래 유전자(표적 DNA)가 삽입되어 원래의 테트라사이클린 내성 유전자를 파괴하기 때문입니다. 따라서 카나마이신이 포함된 배지에서 자라는 세포 중 테트라사이클린에 민감한 세포만 외래 유전자와 재조합된 플라스미드 DNA를 가지고 있습니다.

 

B. DNA 혼합 반응을 이용한 선별 방법

DNA는 구성 염기 간의 상보적인 수소 결합으로 인해 이중 가닥(double stranded)으로 구성된 구조를 가지고 있습니다. DNA를 알칼리나 고온에서 가열하면 염기쌍 간의 수소 결합이 분해되어 단일 가닥(single stranded) 구조로 변화하여 이중 가닥 구조가 끊어집니다. 이를 DNA 변성이라고 합니다. 단일 가닥 DNA는 상보적인 염기쌍을 가진 또 다른 단일 가닥 DNA로, 서로 실질적으로 같거나 매우 유사한 DNA를 만나면 염기쌍 간의 수소 결합으로 다시 이중 가닥 DNA로 변합니다. 이를 DNA 재생이라고 합니다. DNA-DNA 혼성화(hybridization)는 동일하거나 매우 유사한 DNA가 서로 만나 상보적인 염기쌍 사이에 수소 결합을 형성하고 이중 가닥 DNA로 변하는 현상입니다.
이러한 DNA 특성을 사용하면 다양한 유형의 세포 혼합물에서 target DNA를 포함하는 클론을 쉽게 선택할 수 있습니다. 배지에서 세포를 배양한 후 성장한 군락(colony)들을 nitrocellulose 또는 nylon으로 만든 얇은 막으로 옮기고 얇은 막에서 군락(colony)을 녹여 균체의 DNA를 변성시켜 얇은 막으로 고정합니다.
그런 다음 탐침(probe)으로 사용할 재조합 DNA를 만드는 데 사용된 target DNA를 단일 가닥으로 변성시키고 막과 혼합합니다.
얇은 막의 DNA가 탐침(probe) DNA와 같거나 매우 유사한 경우 DNA 분자 사이에 상보적인 수소 결합이 발생합니다(DNA-DNA 혼성화). 일반적으로 탐침(probe)은 방사성 동위원소 또는 발색단으로 표식(labelling) 되므로 얇은 막에서 DNA-DNA 혼성화를 찾을 수 있습니다. 이제부터는 배지에서 성장한 군락(colony)에서 재조합 DNA를 포함하는 군락(colony)을 추적하고 분리할 수 있습니다.

 

C. Immunological assay 법

항원(antigen)과 항체(antibody) 사이의 특정 반응을 이용한 방법으로 재조합 DNA를 만드는 데 사용되는 외래 target DNA는 숙주 세포에서 발현되고 합성된 단백질은 항원이 되고, 항원을 찾기 위한 탐침(probe)으로 사용되는 화합물은 항체가 됩니다.
DNA 혼성화와 유사하며, 고체 배지에서 세포를 배양한 후 군락(colony)을 얇은 막이나 매트릭스로 옮기고 얇은 막과 함께 군락(colony)을 녹여 균체의 단백질을 얇은 막에 고정합니다. 그런 다음 탐침으로 사용되는 염기성 항체를 얇은 막과 혼합하면 target DNA가 합성한 단백질과 결합합니다.
기본 항체에 특이적으로 결합하는 두 번째 항체가 여기에 추가됩니다. 두 번째 항체는 일반적으로 발색 기능을 나타내는 효소를 사용합니다. 예를 들어 alkaline phosphatase가 있습니다. alkaline phosphatase는 특정 무색 기질을 분해하여 유색 화합물을 형성하고, 반응이 발생한 곳에 축적됩니다. 막의 발색 부위는 항원-항체 반응이 일어난 곳이며, target DNA의 발현에 의해 합성된 단백질이 있습니다. 따라서 막의 발색 부위에서 배지에 재조합 DNA가 포함된 클론을 추적하고 분리할 수 있습니다.

 

D. Protein activity 측정법

재조합 DNA를 만드는 데 사용되는 외래 target DNA가 숙주 세포에서 발현되고 단백질이 합성되면 단백질의 활성을 추적하여 재조합 DNA가 포함된 클론을 선택할 수 있습니다. 단백질이 효소인 경우 각 군락의 효소 활성을 측정할 수 있습니다.
또한 효소나 기질 유형에 따라 배지와 그렇지 않은 배지에서 육안으로 재조합 DNA를 포함하는 군락을 쉽게 선택할 수 있습니다. 특히 합성된 단백질이 숙주 세포 성장에 필수적인 요소인 경우 최소 배지(minimal medium)를 사용하여 재조합 DNA를 포함하는 클론의 성장만 조절할 수 있습니다.

이렇게 재조합된 DNA가 들어간 균체를 선별하여 배양함으로써 궁극적으로 우리가 원하는 생성물을 생산하는 생산체로서의 균체를 준비하게 됩니다. 다음 포스팅에서는 유전공학에서 가장 중요한 '중합효소 연쇄반응'과 유전자 재조합 기술의 산업적 이용 분야에 대하여 알아보도록 하겠습니다.